神經(jīng)內(nèi)科畢業(yè)論文
復(fù)方六月雪（CLYX）是通過長(zhǎng)時(shí)期的民間臨床觀察而擬定的治療急慢性乙型肝炎和肝硬化的驗(yàn)方，主要由廣西民間草藥六月青、白花蛇舌草、梔子花根等組成，本課題組前期大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，該方可有效地抑制鴨乙型肝炎病毒DNA 和HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA的'復(fù)制［2，6，8］；無毒濃度的CLYX在HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中可有效地抑制細(xì)胞HBV DNA的復(fù)制及HBsAg（乙型肝炎表面抗原）和HBeAg（乙型肝炎E抗原）的分泌［3，7］；此外，CLYX對(duì)CCl4、AP、D-Gal所致小鼠急性化學(xué)性肝損傷均有明顯的保護(hù)作用，并由此推測(cè)其保肝作用可能與誘導(dǎo)肝藥酶有關(guān)［4］。
1 材料與儀器
1.1 藥物六月青總皂苷，由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室和廣西醫(yī)學(xué)科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心自行提取。
1.2 動(dòng)物Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（250±10）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.3 細(xì)胞株HepG2.2.15細(xì)胞株，購(gòu)自北京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病毒研究所，本室自行傳代，定期用G418篩選。
1.4 試劑阿昔洛韋（Aciclovir ACV）：湖南迪諾制藥有限公司醫(yī)藥工業(yè)研究所產(chǎn)品，批號(hào)： 20070518；RPMI1640培養(yǎng)基：美國(guó)Gibco公司，Cat№21202-016；胎牛血清：美國(guó)Gibco公司，Cat№21607-042；G418：美國(guó)Sigma公司，Cat№228527-72；HBV DNA熒光定量PCR試劑盒：深圳匹基生物工程股份有限公司，批號(hào)：20070613。
1.5 儀器iCycler FQ實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：美國(guó)Bio-Rad公司；CO2孵箱：美國(guó)Thermo Forma公司，Model311。
2 方法
2.1 六月青總皂苷的制備六月青粗粉1.0 kg，加10倍量80%乙醇回流提取3次，1.5 h/次，減壓回收乙醇至無醇味，分別用石油醚、氯仿、醋酸乙酯萃取，棄去有機(jī)溶劑萃取液，最后再用水飽和正丁醇萃取，取正丁醇萃取液減壓濃縮至干，得到41.28 g浸膏，上處理好的AB-8型大孔樹脂柱（40 mm×800 mm），分別用6BV的30%乙醇和50%乙醇洗脫，收集醇洗脫液，減壓回收乙醇， 60℃的減壓恒溫干燥箱中干燥得4.28 g淡黃色化合物，經(jīng)常規(guī)化學(xué)定性試驗(yàn)證實(shí)為皂苷類，利用香草醛-硫酸分光光度法測(cè)定總皂苷含量［5］，純度為85.8%。
2.2 TLYQ含藥血清的制備3月齡Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只。①空白對(duì)照組：予等量的生理鹽水；②陽(yáng)性對(duì)照組：ACV 0.1×10-3 g·kg-1·d-1；③TLYQH組：28.2×10-3 g·kg-1·d-1（相當(dāng)于生藥6.6 g. kg-1·d-1）；④TLYQM組：14.1×10-3 g·kg-1·d-1（相當(dāng)于生藥3.3 g·kg-1·d-1）；⑤TLYQL組：7.1×10-3 g·kg-1·d-1（相當(dāng)于生藥1.7 g·kg-1·d-1）。各組動(dòng)物在同樣條件下飼養(yǎng)，均以2次/d，早晚各1次空腹灌胃，連續(xù)給藥7 d。于末次灌胃（灌胃前禁食不禁水12 h）后2 h，乙醚吸入麻醉，腹主動(dòng)脈抽血，低速離心分離血清，并將每組動(dòng)物的血清混合。經(jīng)56℃ 30 min滅活處理，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜，再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
2.3 熒光定量PCR（FQ-PCR）法檢測(cè)HBV DNA取HepG 2.2.15細(xì)胞1瓶，用胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104 cell·ml-1，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔900 μl，置CO2孵箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)24 h后，分別加入各組含藥血清100 μl，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。以等量的完全培養(yǎng)液為空白對(duì)照。連續(xù)培養(yǎng)72 h后，分別吸出上清液于1.5 ml滅菌Eppendor管中， -20℃保存，統(tǒng)一待檢。再次加入上述含藥血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，分別吸出上清液于1.5 ml滅菌Eppendorf管中， -20℃保存，統(tǒng)一待檢。 按試劑盒方法提取樣品HBV DNA。HBV DNA定量標(biāo)準(zhǔn)品由深圳匹某公司直接提供。各反應(yīng)管放入FQ-PCR儀，按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：94℃預(yù)變性1 min，95℃變性5 s，60℃退火、延伸20 s。共反應(yīng)42個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增過程及熒光信號(hào)檢查、數(shù)據(jù)的儲(chǔ)存和分析均由儀器及其自帶的軟件自動(dòng)完成。
3 結(jié)果
藥復(fù)方成分非常復(fù)雜，其組方配伍多數(shù)是以某一味藥為主其余為輔，諸藥發(fā)揮協(xié)同治療作用。為了能更好地保證CLYX療效穩(wěn)定性，本研究對(duì)該方中的君藥（六月青）進(jìn)行研究，即從六月青提取分離出總皂苷活性部位，并對(duì)其進(jìn)行抗HBV藥效學(xué)研究，篩選出該方有效活性部位，進(jìn)而為下一步分離純化有效化學(xué)成分，建立處方質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。是六月青主要活性部位之一。
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