神經(jīng)生長(zhǎng)因子和增殖細(xì)胞核抗原在人腦膠質(zhì)瘤中意義探究的論文
膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡及血管生成的信號(hào)通路異常有關(guān)。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)主要來(lái)源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可以誘導(dǎo)神經(jīng)纖維生長(zhǎng)，并影響瘤細(xì)胞的增生、分化及凋亡。增殖細(xì)胞核抗原(proliferation cell nuclearantigen，PCNA)是一種反映細(xì)胞增殖的可靠指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化技術(shù)，對(duì)膠質(zhì)瘤中NGF及PCNA的表達(dá)進(jìn)行研究，探討它們與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)的關(guān)系及其在評(píng)估膠質(zhì)瘤患者預(yù)后中的作用。
1 材料與方法
1.1 資料 武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科2010年7月至2012年4月收治的64例腦膠質(zhì)瘤患者，男性36例，女性28例;年齡21-60歲，平均42歲。所有患者手術(shù)前均未接受放療或化療，術(shù)中留取的腫瘤組織標(biāo)本送病理科，經(jīng)兩名病理科醫(yī)師檢查確診。根據(jù)2000年WHO病理學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ級(jí)14例，Ⅱ級(jí)16例，Ⅲ級(jí)18例，Ⅳ級(jí)16例。定義Ⅰ-Ⅱ級(jí)為低級(jí)別膠質(zhì)瘤組，共計(jì)30例;Ⅲ-Ⅳ級(jí)為高級(jí)別膠質(zhì)瘤組，共計(jì)34例。64例患者中，隨訪生存時(shí)間>2年者29例，≤2年者35例。作為對(duì)照的10例正常腦組織標(biāo)本來(lái)自因顱腦損傷行開顱內(nèi)減壓術(shù)的患者，其固定、包埋、切片程序同膠質(zhì)瘤標(biāo)本。
1.2 試劑 兔抗人NGF多克隆抗體(稀釋度1∶150)，PCNA單克隆抗體(稀釋度1∶150)及Ultra-Sensitive SP試劑盒、多聚-L-賴氨酸溶液、DAB顯色試劑盒等購(gòu)于武漢博士德生物制品公司。磷酸鹽緩沖液(phosphonate buffer solution，PBS)購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。抗原采用微波爐加熱進(jìn)行修復(fù)。
1.3 免疫組化染色方法 所有腫瘤及正常腦組織標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定，并石蠟包埋切片(4μm)，免疫組化染色嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，采用微波修復(fù)抗原。陰性對(duì)照標(biāo)本僅以PBS液替代一抗，余操作相同。
1.4 結(jié)果判定 為避免觀察測(cè)量偏倚，對(duì)參與閱片的病理科醫(yī)師采取盲法原則，且由兩名病理科醫(yī)師分別進(jìn)行閱片并確診。NGF陽(yáng)性染色表現(xiàn)為細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)被染成棕黃色;PCNA 陽(yáng)性染色則主要表現(xiàn)為胞核被染成黃色或棕黃色。隨機(jī)選擇5-10個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，陽(yáng)性表達(dá)率按陽(yáng)性染色的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比判斷。將陽(yáng)性表達(dá)率10%-25%定義為(+);25%-50%定義為(-);>50%定義為(+);將標(biāo)本陽(yáng)性細(xì)胞百分率<10%定義為(-)。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間陽(yáng)性表達(dá)率的比較;采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析計(jì)算兩因數(shù)之間的相關(guān)性，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 NGF及PCNA在正常腦組織及膠質(zhì)瘤內(nèi)的表達(dá) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)NGF和PCNA的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常腦組織(P<0.05)，兩者在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組與低級(jí)別膠質(zhì)瘤組間的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率也有顯著差異(P<0.05)，在生存時(shí)間≤2年組中，ngf及pcna陽(yáng)性表達(dá)率均高于生存時(shí)間>2年組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2.2 NGF 與PCNA 的相關(guān)性分析 本研究經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)分析顯示，NGF與PCNA在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05，rs=1.000)。
3 討論
NGF及其受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并存在于大多數(shù)神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞中，維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能，同時(shí)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。目前，NGF與腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)系日益受到關(guān)注，研究已證實(shí)NGF參與了非中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過(guò)程。關(guān)于NGF對(duì)人腦膠質(zhì)瘤的作用，亦有相關(guān)研究。張志堅(jiān)等在體外人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，U251細(xì)胞能夠高表達(dá)NGF并將其分泌至細(xì)胞外，同時(shí)，U251細(xì)胞對(duì)其高親和力受體-酪氨酸蛋白激酶受體A(TrkA)亦有高表達(dá)。細(xì)胞在分裂相貼壁生長(zhǎng)6h后，后者主要定位于細(xì)胞膜，此時(shí)細(xì)胞外NGF與細(xì)胞膜上TrkA 結(jié)合后形成復(fù)合物內(nèi)化入并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi);在細(xì)胞培養(yǎng)12h以及G1/S期時(shí)，兩者共同位于細(xì)胞核內(nèi)，通過(guò)多靶點(diǎn)作用模式對(duì)U251細(xì)胞的生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)控。另外，NGF還能夠通過(guò)TrkA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，抑制機(jī)體產(chǎn)生與分泌腫瘤相關(guān)的免疫球蛋白，從而有助于腫瘤細(xì)胞的免疫逃避。而更早的研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、U87和U373細(xì)胞可在外源性NGF的作用下增殖，其增殖效應(yīng)呈現(xiàn)NGF的劑量依賴性。
本研究發(fā)現(xiàn)顯微鏡下可見NGF主要表達(dá)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的胞質(zhì)和胞核，并且在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯高于其在正常腦組織中的表達(dá)(P<0.05)，并隨著膠質(zhì)瘤惡性級(jí)別的增高而表達(dá)增強(qiáng)。另外，ngf在生存時(shí)間≤2年組中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于其在生存時(shí)間>2年組的表達(dá)。以上研究說(shuō)明，NGF與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)密切相關(guān)，并能對(duì)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。
膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性很強(qiáng)，而PCNA 為人類基因組中高度保守的基因，僅在增殖細(xì)胞中合成，很少存在于靜止期的細(xì)胞中，研究表明，檢測(cè)PCNA與腫瘤的增殖特性密切相關(guān)，對(duì)判斷腫瘤的分化程度和腫瘤患者的預(yù)后有重要的參考價(jià)值，并能作為腦膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)指標(biāo)。
本研究顯示，正常腦組織中未見PCNA的表達(dá)，而在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PCNA 呈陽(yáng)性表達(dá)，且高級(jí)別膠質(zhì)瘤組中PCNA 的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于其在低級(jí)別膠質(zhì)瘤組中的表達(dá)(P<0.05)，提示PCNA表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的惡性行為相關(guān)。同時(shí)對(duì)不同生存時(shí)間患者的腫瘤細(xì)胞中PCNA 的.表達(dá)率進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PCNA的表達(dá)水平與患者術(shù)后生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，因此我們認(rèn)為，膠質(zhì)瘤中PCNA的表達(dá)水平可作為評(píng)估患者預(yù)后的指標(biāo)。
在一項(xiàng)體外培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究中，受NGF作用的HUEVC304細(xì)胞中，PCNA 的表達(dá)增加明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，提示NGF可能對(duì)PCNA 的表達(dá)有促進(jìn)作用。本研究發(fā)現(xiàn)人腦膠質(zhì)瘤組織中的NGF和PCNA蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，進(jìn)一步提示了NGF可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，亦提示NGF及PCNA可能在膠質(zhì)瘤的侵襲及惡性進(jìn)展過(guò)程中起著協(xié)同作用，二者在人腦膠質(zhì)瘤組織中的高度表達(dá)，預(yù)示著膠質(zhì)瘤的惡性程度高，患者的預(yù)后差。繼續(xù)深入研究二者在膠質(zhì)瘤侵襲性中的相關(guān)關(guān)系，并進(jìn)一步探討其詳細(xì)的生物學(xué)機(jī)制，為從分子水平上進(jìn)行膠質(zhì)瘤的治療提供了新的方向。
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