HIV-1Rev蛋白和人DDX3解旋酶對HCVRNA復制產生的作用研究論文
丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)和人類免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus，HIV)的傳播途徑十分相似，約30%的HIV陽性患者合并HCV感染。在中國的靜脈藥癮的HIV感染者中，HCV陽性率可高達90%。HCV患者合并感染HIV將加速丙型肝炎病程進展，同時降低抗HCV療效。近年較多研究表明，對合并感染患者針對HIV進行嚴格的高效抗逆轉錄病毒治療(highlyactiveantiretroviraltherapy，HAART)不能有效地改善這些情況，同時HCV病程加速也與CD4+T淋巴細胞數(shù)量下降無明顯關聯(lián)。我們前期的研究也證實，HIV合并感染可能導致患者體內HCV準種分布特征改變，但HCV載量及準種復雜度與CD4+T淋巴細胞數(shù)量無關。以上證據(jù)提示HIV對HCV的影響可能存在其他途徑。有研究證實HCV、HIV可以共感染同一肝細胞，進而可能導致兩種病毒在同一細胞內發(fā)生相互作用。HCV、HIV均為RNA病毒，而DDX3在人體細胞內與RNA的復制過程關系密切，已有研究證實DDX3可與HCVCore蛋白結合促進HCV的復制。同時發(fā)現(xiàn)HIV-1Rev蛋白可與DDX3結合在核膜上形成復合體從而導致細胞質內DDX3的水平下降，也有研究表明，Rev蛋白可以與HCV5'-UTR作用直接促進HCV的復制。但是尚未有研究證實Rev蛋白可以通過間接作用影響HCV的復制，或通過影響其他細胞代謝途徑影響HCV的復制，也沒有研究證實Rev蛋白和DDX3可以共同作用并對HCV的復制產生影響。
本實驗通過分別構建HCVRNA復制細胞模型及表達DDX3、Rev+DDX3的HCVRNA復制細胞模型，研究Rev蛋白和DDX3對HCVRNA復制的影響。旨在為進一步深入研究Rev蛋白和DDX3是否通過共同作用，從而影響HCVRNA復制。
1材料與方法
1.1材料
Huh7肝癌細胞系和HCV復制模型pCDNA3.1-JFH1均為本實驗室保存，Huh7細胞系生長于含10%滅活小牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、氨芐青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100U/mL)和DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。實驗中主要材料包括:真核過表達質粒pCDNA3.1(鼎國生物技術有限公司，北京)，各種工具酶、核酸標準分子量Marker以及蛋白質預染Marker(天根生化有限公司，北京)，去內毒素質粒大量提取試劑盒(Qiagen公司，德國)，質粒轉染轉染試劑Lipofectamine2000(Invitrogen公司，美國)，鼠抗Flag單克隆抗體(Sigma公司，美國)、兔抗人GAPDH單克隆抗體、小鼠抗人DDX3單克隆抗體、小鼠抗HIVRev單克隆抗體(Abcam公司，美國)，HRP標記的羊抗兔IgG二抗，HRP標記的羊抗小鼠IgG二抗(福州邁新公司中國)，qPCR引物由Invitrogen公司合成。
1.2方法
1.2.1含Rev、DDX3基因重組真核表達載體的構建查詢NCBI獲得Rev蛋白和DDX3的基因表達序列，并分別在其基因的5'端引入限制性酶切位點EcoRⅠ和增強表達的Kozak序列，3'端引入限制酶切位點XbaⅠ和便于Rev、DDX3表達檢測的Flag標簽蛋白(DYKDDDDK)編碼序列，以及便于觀察轉染效率的mCherry和YFP序列。以上相關基因序列由深圳華大生物科技有限公司協(xié)助合成。進一步分別將各自基因序列插入真核過表達載體pCDNA3.1中命名為pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pcDNA3.1-DDX3-YFP-Flag。從GenBank中查詢目的基因以及上下游的序列，用VectorNTI軟件進行PCR引物設計。載體pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry正向引物(5'-AGTCCAGTGTGGTGGAATTCGCCACCATGGAGCCAGTAGATCCTAG-3')(含同源重組序列、EcoRⅠ酶切位點、Kozak序列，并含有目的基因5'端配對序列)，(5'-TAGTCCATGGTGGCGAATTCTTCTTTAGTTCCTGACTCCAATAC-3')(含同源重組序列、EcoRⅠ酶切位點，并含有目的基因3'端配對序列)。載體pcDNA3.1-DDX3-YFP-Flag正向引物5'-ACGATGACGATAAGCTCGAGGCCACCATGAGTCATGTGGCAGTGG-3'(含同源重組序列、XhoⅠ酶切位點、Kozak序列，并含有目的基因5'端配對序列)，反向引物5'-GTTTAAACGGGCCCTCTAGATCAGTTACCCCACCAGTCAAC-3'(含同源重組序列、XbaⅠ酶切位點，并含有目的基因3'端配對序列)。
1.2.2重組pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pcDNA3.1-DDX3-YFP-Flag質粒的鑒定用構建好的重組pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pcDNA3.1-DDX3-YFPFlag質粒分別轉化入大腸桿菌DH5α中，均勻涂布接種于含有氨芐青霉素的瓊脂糖平板上，次日挑取陽性單克隆菌落搖菌擴增后，抽提質粒進行PCR擴增并進行瓊脂糖凝膠電泳，對擴增產物進行回收，并進行核酸測序。
1.2.3重組pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag及pCDNA3.1-JFH1質粒的轉染采用Lipofectamine2000轉染試劑，實驗步驟按照使用說明書進行操作。將重組pCDNA3.1-Rev-FlagmCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag質粒分別瞬時轉染入Huh7細胞中，通過熒光顯微鏡觀察轉染效率。pCDNA3.1-JFH1瞬時轉染入Huh7細胞中，qPCR檢測HCV的復制情況。
1.2.4Westernblot鑒定Rev、DDX3基因在Huh7細胞中的表達分別轉染48h后，提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳。在4℃下、300mA恒流條件下電轉120min，用封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST)室溫封閉PVDF膜1h，TBST洗膜3次，每次10min，一抗加入1∶5000比例稀釋的anti-Rev單克隆抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10min，二抗加入1∶5000比例稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育2h，TBST洗膜3次，每次10min�；瘜W發(fā)光試劑檢測，以GAPDH為內參。
1.2.5qPCR檢測細胞內Rev、DDX3對HCV復制的影響用Lipofectamine2000轉染試劑，實驗按照使用說明書進行操作。將pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag和pCDNA3.1-JFH1瞬時共轉染入Huh7細胞中，qPCR檢測HCV復制情況。將pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag及pCDNA3.1-JFH1瞬時共轉染入Huh7細胞中，qPCR檢測HCV復制情況。查詢NCBI中HCV基因組序列，以5'非翻譯區(qū)為模板設計引物，引物序列為HCV-F:5'-CCCTGTGAGGAACTACTGTCTT-3';HCV-R:5'-TGAGCGGGTTTATCCAAG-3'。引物序列由美國Invitrogen公司合成。擴增條件為95℃預變性1min，95℃變性10s，58℃退火擴增30s，循環(huán)40次，最后添加65～95℃溶解曲線。標準曲線:取1μgPCDNA3.1-JFH1按10倍梯度稀釋5個梯度后按上述體系進行Real-timePCR檢測，最終將每個梯度的Ct值帶入對應終濃度計算函數(shù)，最終以該函數(shù)計算每個樣品中對應的HCV復制水平。
1.3統(tǒng)計學處理
采用SPSS17.0進行統(tǒng)計，實驗組與對照組采用兩獨立樣本t檢驗檢測均值是否有顯著性差異。
2結果
2.1重組pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag真核表達載體的鑒定含pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherryg質粒的菌液經擴增培養(yǎng)后提取純化質粒，進行PCR鑒定，產物經5%瓊脂糖凝膠電泳，分別出現(xiàn)1條特異性條帶，均位于400bp附近。核酸序列測定結果顯示，克隆的外源基因全長394bp。含pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag質粒的菌液經擴增培養(yǎng)后提取純化質粒，進行PCR鑒定，產物經5%瓊脂糖凝膠電泳，分別出現(xiàn)2條特異性條帶，分別位于2000bp附近，選擇與預期產物大小接近的條帶進行膠回收并測序。核酸序列測定結果顯示，克隆的外源基因全長2035bp。通過對克隆的外源基因序列測序并和GenBank中Rev和DDX3序列對比，證實其基因序列100%同源，提示Rev和DDX3真核表達載體構建成功。
2.2Rev、DDX3基因分別在Huh7細胞中的表達重組pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag質粒分別轉染Huh7細胞，轉染24h后用熒光顯微鏡觀察熒光，可見Rev在熒光顯微鏡下發(fā)紅光，DDX3在熒光顯微鏡下發(fā)黃光;轉染48h后提取細胞總蛋白，通過Westernblot檢測Rev蛋白和DDX3的表達，凝膠成像儀成像結果證明重組pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag質粒能在Huh7細胞中表達相應的蛋白。
2.3DDX3對細胞HCV復制的影響重組pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag和pCDNA3.1-JFH1質粒共轉染Huh-7細胞，48h后用TRIzol法提取細胞總RNA，qPCR檢測HCV的復制水平，進行對照組與實驗組的兩獨立樣本t檢驗。結果表明，瞬時轉染DDX3和HCV復制質粒后，HCV的復制水平(1.09×107±0.18×107)明顯高于HCV復制質粒單獨轉染后的HCV復制水平(4.79×106±1.24×106)(P=0.03)。提示，DDX3可以增強HCV在細胞中的復制。
2.4Rev和DDX3共同作用對細胞HCV復制的影響重組pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag和pCDNA3.1-JFH1質粒共轉染入Huh-7細胞中，轉染48h后，提取細胞總RNA，進行qPCR檢測HCV的復制水平，進行對照組與實驗組的兩獨立樣本t檢驗。結果表明，Rev、DDX3和HCV復制質粒共轉染Huh-7細胞后，HCV的復制水平(1.74×107±0.40×107)明顯低于HCV單獨轉染后的HCV復制水平(4.17×107±0.46×107)(P<0.001)。Rev蛋白和DDX3共同作用可以抑制HCV的復制。
3討論
有研究證實循環(huán)血液中的HIVgp120蛋白在與肝細胞表面CCR5和CXCR4接觸后可激活肝細胞內TGFβ-1表達從而促進肝細胞內HCV的復制。有研究發(fā)現(xiàn)可以從CD4-CXCR4+的原代肝細胞中成功分離出HIV;并且Fromentin證實CD4-CXCR4-的某些肝癌細胞株也可以感染HIV。證明HIV和HCV可共感染同一肝細胞，表明二者有產生直接作用的可能。在HIV、HCV共感染的患者中，HIV可以促進HCV的復制，而且加速肝纖維化的進程。HIV合并HCV感染患者與HIV單獨感染患者比較，肝臟相關疾病是非AIDS引起死亡的主要原因。最新的研究表明，HIV和HCV合并感染加速疾病的進程，特別是HIV感染增加HCV的復制、肝細胞凋亡、腸道微生物的移位、損傷HCV的特異性免疫應答。對HIV合并HCV的患者分別進行HIV的抗病毒治療和HCV的抗病毒治療，結果表明抗病毒治療有效的'延緩了肝纖維化的進程并減少了HIV合并HCV感染的患者終末期肝病的并發(fā)癥。然而HIV合并HCV感染的患者接受常規(guī)的PEG-IFN聯(lián)合利巴韋林治療所產生的持續(xù)性病毒學應答要比單獨HCV患者有明顯的降低。
有研究表明，在HIV-1致病過程中，Rev蛋白發(fā)揮著重要作用，其可以促進HIV-1病毒顆粒的產生，并可以抑制病毒所有調節(jié)蛋白的產生。因HIV和HCV在細胞復制中無法自身合成RNA解旋酶，其在細胞中的復制需要細胞內的RNA解旋酶參與。DDX3屬于DEAD解旋酶家族，DDX3參與多種細胞進程，包括mRNA的剪接和轉錄、翻譯的起始和RNA的轉運。有研究顯示，DDX3可以與HIV-1中的Tat蛋白作用，刺激病毒mRNA的翻譯，也可以和Rev蛋白作用參與REV-RRE介導的輸出作用。有研究表明DDX3與HCVCore蛋白結合促進HCV的復制。同時也有學者發(fā)現(xiàn)HIV-1Rev蛋白可與DDX3結合在核膜上形成復合體從而影響細胞質內DDX3的水平。也有研究發(fā)現(xiàn)Rev蛋白可以與HCV5’-UTR作用直接促進HCV的復制。但是尚未有研究證實Rev可以通過間接作用影響HCV的復制，也沒有研究證實Rev蛋白和DDX3共同作用對HCV的影響。
本研究證實pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry、pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag可以在真核細胞中表達;轉染后48hqPCR檢測發(fā)現(xiàn)，DDX3單獨與HCV作用時，可以促進HCVRNA的復制;當Rev和DDX3共同作用于HCV時，可以有效抑制HCVRNA的復制。可能原因:①Rev和DDX3在細胞中結合形成復合物，降低了細胞內DDX3的水平，降低了DDX3對HCVRNA的復制作用，從而競爭性抑制了DDX3對HCV復制的影響;②也有可能通過抑制某些信號通路從而影響HCVRNA的復制，因為Rev和DDX3不僅在HCV的表達中起作用，而且參與細胞中的多種信號通路，Rev和DDX3形成復合物后也抑制了相應的信號通路，導致HCVRNA的表達量下降;③或者改變了Rev和DDX3在細胞中的分布，導致它們無法在指定的作用位點與HCV進行相互作用，從而導致HCVRNA表達量的下降。
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