PCR自我鑒定
篇一：PCR個(gè)人經(jīng)驗(yàn)總結(jié)
PCR經(jīng)驗(yàn)總結(jié)
1. primers design
這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件
a 足夠長(zhǎng),18-24bp,以保證特異性.當(dāng)然不是說(shuō)越長(zhǎng)越好,太長(zhǎng)的引物同樣會(huì)降低特異性,并且降低產(chǎn)量。
b GC% 40%-60%
c 5'端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性
d 避免3'端GC rich, 最后3個(gè)BASE不要有GC,或者最后5個(gè)有3個(gè)不要是GC e. 避免3'端的互補(bǔ), 否則容易造成DIMER
f. 避免3'端的錯(cuò)配
g. 避免內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)
h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時(shí)不需要加上這些序列,但在檢測(cè)互補(bǔ) 和二級(jí)結(jié)構(gòu)是要加上它們
i. 需要使用兼并引物時(shí), 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1uM-3uM)
j. 最好學(xué)會(huì)使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.
* 引物的另一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度.Tm對(duì)于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比引物的 Tm低5℃。
設(shè)定Tm有幾種公式。有的是來(lái)源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預(yù)測(cè)引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算機(jī)程序使用近鄰分析法。 根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會(huì)差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋�(gè)估算的Tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)�？梢酝ㄟ^(guò)分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。
為獲得最佳結(jié)果，兩個(gè)引物應(yīng)具有近似的Tm值。引物對(duì)的Tm差異如果超過(guò)5℃，就會(huì)引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
2. stability of primers
定制引物的標(biāo)準(zhǔn)純度對(duì)于大多數(shù)PCR應(yīng)用是足夠的。引物產(chǎn)量受合成化學(xué)的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運(yùn)輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因?yàn)樗膒H經(jīng)常偏酸，會(huì)引起寡核苷的水解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲(chǔ)存條件。應(yīng)將干粉和溶解的引物儲(chǔ)存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在 -20℃可以穩(wěn)定保存6個(gè)月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存 2個(gè)月。
3. optimize reactants concentration
a. magnesiom ions
Mg離子的作用主要是 dNTP-Mg 與核酸骨架相互作用，并能影響Polymerase的活性。
一般 的情況下 Mg的濃度在0.5-5mM之間調(diào)整。同樣要記住的是在調(diào)整了dNTPs的濃度后要相應(yīng)的調(diào)整Mg離子的濃度。對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR，使用3-5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液。
b. 其他的離子
NH4+ K+都會(huì)影響PCR。增加K+的濃度后, 會(huì)因?yàn)橹泻土撕怂峁羌苌狭姿峄鶊F(tuán)的負(fù)電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的 嚴(yán)謹(jǐn)性(stringency).NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了兩種BUFFER, 一種是加Mg的一種是已經(jīng)混合了(NH4)2SO4的.當(dāng)然, 過(guò)高的陽(yáng)離子濃度(KCL>0.2M)時(shí), DNA在94度根本不會(huì)發(fā)生變性, 當(dāng)然也就無(wú)從談起PCR了.
c. polymerase
不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度。一些高保真酶的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情況下, 變性的溫度可以使用90~92度, 變性的時(shí)間也可以縮短,從而保證polymerase的活性 d. template
50ul PCR SYSTEM
human gDNA 0.1ug-1ug
E.Coli 10ng-100ng
Lamada DNA 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng
4. temperature
a. denaturation
常規(guī)是94度5分鐘, GC Rich的摸板是95度5分鐘，除了GC Rich外, 常規(guī)的APPLICATIONS可以將這部分時(shí)間縮短到1到2分鐘, 或者在CYCLE 1時(shí)給予較長(zhǎng)的時(shí)間,而取消開始的denaturation
b. annealing
重點(diǎn)到了。一般情況下, 是從55度開始.根據(jù)情況配合以Mg離子濃度進(jìn)行調(diào)整. 有條件的可以做gradient pcr. 退火的時(shí)間在30-60S, 時(shí)間短一些可以得到更好的效果. 因?yàn)? polymerase 在annealing temp.時(shí)也會(huì)有一些活性. 所以在A.T.的時(shí)間過(guò)長(zhǎng), 會(huì)極大的增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn).另外,在對(duì)于一些困難戶, 比如從gDNA里擴(kuò)增大片段, 還可使用two step PCR.
5. touchdown PCR
原理很簡(jiǎn)單,但的確是一個(gè)很有用的方法。舉個(gè)例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度 94 5min—（94 30s—60 30s—72 1min）×2—（94 30s—59 30s—72 1min ）×2—（94 30s—58 30s—72 1min）×2—........—（94 30s—51 30s—72 1min）×2—（94 30s—50 30s—72 1min）×20—72 5min
6. hot start PCR
熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進(jìn)行PCR反應(yīng)配制過(guò)程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會(huì)被有效擴(kuò)增。在用于引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)因?yàn)檫z傳元件的定位而受限時(shí)，如site-directed突變、表達(dá)克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構(gòu)建和操作，熱啟動(dòng)PCR尤為有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應(yīng)液，并
將其置于預(yù)熱的PCR儀。這種方法簡(jiǎn)單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴(kuò)增。
熱啟動(dòng)通過(guò)抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶，在反應(yīng)體系達(dá)到90度時(shí)，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這個(gè)方法 過(guò)于煩瑣，尤其是對(duì)高通量應(yīng)用，并容易造成污染。其他的熱啟動(dòng)方法使用蠟防護(hù)層將一種基本成分，加入鎂離子或酶，包裹起來(lái)，或者將反應(yīng)成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時(shí)，因蠟熔化而把各種成分釋放出來(lái)并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。
ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)
Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)
Magnesium wax beads (Stratagene).
象手動(dòng)熱啟動(dòng)方法一樣，蠟防護(hù)層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應(yīng)用。還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗體抑制失活，當(dāng)變性溫度超過(guò)70度時(shí)，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。
7. Booster PCR
我們知道1ug human genomic DNA 大約在3X105個(gè)模板分子,這樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結(jié)合. 當(dāng)模板的濃度過(guò)低,比如低于100個(gè)分子時(shí), 引物和模板之間就很難發(fā)生反應(yīng). 引物容易自身進(jìn)行反應(yīng)形成二聚體.這樣就有來(lái)了個(gè) booster PCR 我一直找不到合適的詞來(lái)翻譯這個(gè)booster.具體是這樣的.開始幾個(gè)cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的 molar ratio在107~ 108. 以確保開始擴(kuò)增的準(zhǔn)確性.然后booste Primer的濃度到正常的水平
8. 循環(huán)數(shù)和長(zhǎng)度
確定循環(huán)數(shù)的基本原理是: 產(chǎn)物能夠保證你進(jìn)一步分析操作的最小循環(huán)數(shù).因?yàn)檫^(guò)多的循環(huán)數(shù)容易造 成ERRORS和非特異性產(chǎn)物的`積累、產(chǎn)物的量不夠, 優(yōu)化的方法有:
1. 增加TEMPLATE
2. 增加循環(huán)數(shù)
如何確定循環(huán)數(shù),有一個(gè)方法.做一個(gè)PCR體系,40循環(huán),50ul, 分別在20,25,30,35循環(huán)時(shí)從體系中取5ul,一起跑電泳分析.從而確定最佳的循環(huán)數(shù)另一個(gè)會(huì)影響PCR特異性的是PCR cycling時(shí)在兩個(gè)溫度間變化的速率(ramping rate).當(dāng)然是越高越好.不過(guò)咱們大部分條件有限,就那么幾臺(tái)PCR儀,也沒有多少挑選的余地
9. thermal cycler
PCR儀的因素我們經(jīng)常容易忽視.長(zhǎng)時(shí)間的使用后需要調(diào)整PCR儀,以保證其能夠到達(dá)正確的溫度.現(xiàn)在的PCR儀基本上都有自檢功能(self-diagnosis).
10. PCR additives
附加物或者說(shuō)enhancer實(shí)在是多種多樣. 基本上包括幾類, 能夠增加反應(yīng)退火效率的化學(xué)因子, DNA結(jié)合蛋白和一些商業(yè)試劑. 基本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯(cuò)配, 增加產(chǎn)物的長(zhǎng)度和產(chǎn)量.在GC Rich情況中, additive可以造成配對(duì)堿基間的的不穩(wěn)定,從而提高擴(kuò)增的效率.而在另一種情況下,additive由于造成錯(cuò)配的primer-template 復(fù)合物的極大的不穩(wěn)定, 而提高了擴(kuò)增的忠實(shí)性.要注意的是,沒有萬(wàn)能的enhancer全部通用,需要你根據(jù)自己的情況,最好結(jié)合gradient pcr選擇最優(yōu)條件.
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dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%
formamide at 5%
trimethylammonium chloride 10-100uM
detergents such as Tween 20 0.1-2.5%
polyethylene glycol (PEG)6000 5-15%
glycerol 10-15%
single stranded DNA binding proteins
Gene 32 protein 1nM
E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM
7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP
Taq Extehder (stratagene)
Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)
Q-solution(Qiagen)
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要注意的是,DMSO,GLYCEROL等會(huì)抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最適的濃度
11. Template DNA preparation
提取DNA時(shí)的試劑會(huì)抑制PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行.因此需要對(duì)TEMPLATE DNA進(jìn)行純化.特別是SDS(<0.01%) 的情況下就能強(qiáng)烈抑制PCR的進(jìn)行. 可以加入一些nonionic試劑,如Tween, Nonid, Trition之類的反過(guò)來(lái)抑制SDS. 還有proteinase K也要除干凈, 不然會(huì)降解polymerase.
12. Nested PCR
簡(jiǎn)單點(diǎn)說(shuō) 設(shè)計(jì)兩對(duì)引物, 一對(duì)是長(zhǎng)的, 一對(duì)是包含在長(zhǎng)引物內(nèi)的, 用長(zhǎng)引物擴(kuò)增的產(chǎn)物作為第二次擴(kuò)增的模板,這樣可以增加產(chǎn)物的量. 而且可以減少非特異性帶和錯(cuò)配的情況. 增加PCR的保真性
高保真酶
高溫DNA POLYMERASE是以單鏈DNA或RNA為模板，在dNTP和一些陽(yáng)離子的存在情況下，在特定的引物指導(dǎo)下按3'-5'方向合成DNA.包括3種類型：
a.5'-3'方向的DNA合成能力,沒有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突變體.這類酶的合成能力強(qiáng),因?yàn)樗患m正合成中出現(xiàn)的突變
b.與a類似,有合成活性,沒有3-5的外切活性.但他們能以RNA為模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerase
c.有DNA聚合活性,沒有逆轉(zhuǎn)錄活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠實(shí)性。但是這些聚合酶的產(chǎn)量比Taq DNA聚合酶低。 酶的混合物
將Taq DNA聚合酶同帶有3'到5'外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨(dú)Taq DNA聚合酶高的忠實(shí)性，并可以得到高產(chǎn)量及擴(kuò)增長(zhǎng)模板。
其他因素
除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會(huì)降低忠實(shí)性。將dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以增加精確度如果四種核苷的濃度不同，忠實(shí)性會(huì)受影響。進(jìn)行較少的PCR循環(huán)也會(huì)有助于增加忠實(shí)性，因?yàn)樵黾友h(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長(zhǎng)度就會(huì)增加突變可能性。
篇二：醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)自我鑒定范文
醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)自我鑒定范文
英語(yǔ)水平：具有一定的英語(yǔ)聽說(shuō)讀寫能力
計(jì)算機(jī)水平：國(guó)家計(jì)算機(jī)一級(jí)
普通話水平：國(guó)家二級(jí)
學(xué)習(xí)經(jīng)歷：xx年8月至xx年7月 尉氏三中
xx年9月至xx年7月 山東聊城職業(yè)技術(shù)學(xué)院
實(shí)習(xí)經(jīng)歷：xx年8月至xx年1月在開封市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，輸血科實(shí)習(xí)
xx年2月至今在開封市淮河醫(yī)院檢驗(yàn)科實(shí)習(xí)
興趣特長(zhǎng)：對(duì)專業(yè)理論知識(shí)掌握牢固并能熟練應(yīng)用，對(duì)臨檢室，生化室，免疫室，細(xì)胞室等操作熟練。
擅長(zhǎng)乒乓球，喜歡舞蹈，音樂(lè)
自我評(píng)價(jià)：極有耐心，為人誠(chéng)懇，樂(lè)于助人，積極向上，有較強(qiáng)的團(tuán)隊(duì)意識(shí)和學(xué)習(xí)能力，業(yè)務(wù)知識(shí)熟練，社會(huì)適應(yīng)能力強(qiáng)，多才多藝
求職意向：與檢驗(yàn)相關(guān)職業(yè)
醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)個(gè)人自我鑒定范文(三)
本人在校期間認(rèn)真完成了本科階段的專業(yè)知識(shí)，涉獵了許多醫(yī)學(xué)書刊及文獻(xiàn)，熟練的掌握了基礎(chǔ)理論知識(shí)及操作技術(shù)，有很強(qiáng)的責(zé)任心和敬業(yè)精神，專業(yè)知識(shí)過(guò)硬，有旺盛的求知欲，廣泛愛好，時(shí)間觀念強(qiáng);嚴(yán)于自律，吃苦耐勞;團(tuán)隊(duì)親和力強(qiáng)，有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力。 具有兩年實(shí)習(xí)經(jīng)歷的我積累了很多的臨床經(jīng)驗(yàn)，熟悉和掌握了各科常見疾病的診療常規(guī)及治療原則，能夠正規(guī)全面系統(tǒng)的進(jìn)行體格檢查、及時(shí)完成醫(yī)療文件書寫，了解常用藥物的劑量及用法;多次參加危重癥患者的搶救，進(jìn)行了專業(yè)的“三基”培訓(xùn)，實(shí)習(xí)期間可獨(dú)立完成檢驗(yàn)任務(wù)，能夠與帶教老師達(dá)成共識(shí)，得到了醫(yī)院領(lǐng)導(dǎo)及老師的肯定。可熟練完成臨床檢驗(yàn)的基本操作等。所以我希望找一份與自身知識(shí)結(jié)構(gòu)相關(guān)的工作，如醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)可以有更大的空間來(lái)證明自己，發(fā)展自己!
醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)個(gè)人簡(jiǎn)歷自我鑒定范文(四)
本人曾在校社團(tuán)聯(lián)合會(huì)網(wǎng)絡(luò)信息部和檢驗(yàn)學(xué)院學(xué)生會(huì)工作，并擔(dān)任班干部;在校期間，組織策劃了“廣東醫(yī)學(xué)院首屆電子賀卡設(shè)計(jì)大賽”和“廣東醫(yī)學(xué)院首屆電子競(jìng)技大賽”;加入了檢驗(yàn)學(xué)院科研小組，成功申請(qǐng)并參與了“高效液相色譜儀檢測(cè)兒童食品中的色素含量”。這些經(jīng)歷培養(yǎng)了我良好的領(lǐng)導(dǎo)、管理、協(xié)作、交際溝通和創(chuàng)新能力，使我能客觀理智地面對(duì)問(wèn)題，顧全大局，對(duì)凡事持尋求解決的態(tài)度。
一年的實(shí)習(xí)工作更是豐富了我的閱歷，培養(yǎng)了我開拓創(chuàng)新的思維和解決問(wèn)題的能力，更加系統(tǒng)地掌握了臨床各項(xiàng)檢測(cè)的基礎(chǔ)理論和基礎(chǔ)操作技術(shù)，掌握了微生物、病毒的實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)原理和操作技術(shù)，熟悉專業(yè)儀器(如：pcr儀、酶標(biāo)儀、icp儀，氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，高效液相色譜儀，熒光光譜儀等)的性能和運(yùn)用，有較強(qiáng)的綜合分析能力和動(dòng)手能力，也具有一定的科研能力。
我性格開朗、積極上進(jìn);具有良好的團(tuán)隊(duì)精神和人際關(guān)系，對(duì)待工作認(rèn)真負(fù)責(zé)、勤懇耐勞，耐心細(xì)心，在工作中善于到激勵(lì)他人的作用，同時(shí)善于并熱愛與人溝通交流;敢于開拓創(chuàng)新，有著強(qiáng)烈的事業(yè)心與責(zé)任感，對(duì)人生和事業(yè)充滿熱情和憧憬。
醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)畢業(yè)生個(gè)人簡(jiǎn)歷自我鑒定范文(五)
我于xx年9月經(jīng)過(guò)普通高考考入南方醫(yī)科大學(xué)(原第一軍醫(yī)大學(xué))，本人性格開朗、穩(wěn)重、有活力，待人熱情、真誠(chéng)。工作認(rèn)真負(fù)責(zé)，積極主動(dòng)，能吃苦耐勞。有較強(qiáng)的組織能力、實(shí)際
動(dòng)手能力和團(tuán)體協(xié)作精神，能迅速的適應(yīng)各種環(huán)境，并融合其中。認(rèn)真的學(xué)習(xí)態(tài)度和對(duì)本專業(yè)的濃厚的興趣，讓我在各方面都表現(xiàn)出色。
從大一開始，我就特別注重在認(rèn)真學(xué)習(xí)好理論課的同時(shí)，努力培養(yǎng)自身的綜合素質(zhì)，為學(xué)好專業(yè)課打下了良好的基矗從理論轉(zhuǎn)為專業(yè), 我熱愛我的專業(yè)并為之投入了巨大的熱情和精力，充分利用課余時(shí)間，拓寬知識(shí)視野，完善知識(shí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)閱讀大量的課外相關(guān)書籍來(lái)充實(shí)自己的專業(yè)知識(shí)。在競(jìng)爭(zhēng)日益激烈的今天，我堅(jiān)信只有多層次，全方位, 高要求的發(fā)展，并熟練掌握專業(yè)知識(shí)的人才，才符合社會(huì)發(fā)展的需要, 才符合用人單位的需求，才符合自身發(fā)展的要求。
在校期間，我還積極參加學(xué)院. 大學(xué)生運(yùn)動(dòng)會(huì)等多項(xiàng)大型活動(dòng)，培養(yǎng)了我的交際能力，使我懂得了如何與人和睦相處。多年的軍校生活造就了我不怕苦不怕累的態(tài)度, 使我處事更務(wù)實(shí)、更有責(zé)任感。實(shí)習(xí)期間我嚴(yán)格遵守醫(yī)院的各項(xiàng)制度, 積累了豐富的工作經(jīng)驗(yàn)，和完善的專業(yè)技能. 這一切都是我不懈努力的結(jié)果，也是我所具有積極進(jìn)取精神的體現(xiàn)。相信這將是我今后的工作的重要經(jīng)驗(yàn)和寶貴財(cái)富。
深厚的專業(yè)知識(shí)，完整的知識(shí)結(jié)構(gòu)，豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，樂(lè)觀豁達(dá)的性格，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)能娦Ｉ? 超強(qiáng)的團(tuán)體協(xié)作精神和親和力，定會(huì)助我在曲折中順利完成各項(xiàng)工作任務(wù)。
愿貴醫(yī)院給我一次嘗試施展自己潛能的機(jī)會(huì)，我會(huì)盡心盡責(zé)，盡我所能，讓貴醫(yī)院滿意，讓患者滿意!
篇三：菌落PCR鑒定
�。┚銹CR鑒定轉(zhuǎn)化子
1. PCR mix的制備
Taq buffer（10×） 20 μL
(轉(zhuǎn) 載于:wWw.cnboThwiN.cOM 博 威范文 網(wǎng):pcr室自我鑒定)
dNTP（2.5 mmol/L）5 μL
Primer Forward（50 mmol/L） 10 μL
Primer Reverse（50 mmol/L） 10 μL
ddH2O 147 μL
Taq（2U/μL） 8 μL
total 200 μL
將上述溶液混勻，10 μL每管分裝于200 μL PCR管中。
2. 常溫下隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化板上的轉(zhuǎn)化子，用滅菌的牙簽或槍頭挑取少量菌體，在LB瓊脂糖平板上輕點(diǎn)，做一拷貝；然后將沾有菌體的牙簽或槍頭置于相應(yīng)的裝有PCR混合物的PCR管中洗滌數(shù)下（管子做好記號(hào)，將平板上點(diǎn)的克隆標(biāo)號(hào)與管子上的對(duì)應(yīng)起來(lái)，以便篩選到克隆后進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)），蓋緊管子。
3. 將混有菌體的PCR混合物置于PCR儀中，按常規(guī)條件擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序根據(jù)具體的引物設(shè)置，參考下列程序：
95℃，3 min
95℃，30 s 56℃，30 s 72℃，50 s 30個(gè)循環(huán)
72℃，10 min。
4. 電泳檢測(cè)是否得到目的片斷。如有則為陽(yáng)性克隆。（取5 μL PCR反應(yīng)液與1 μL上樣緩沖液混合，進(jìn)行1% 瓊脂糖電泳，5V/cm，選擇適當(dāng)大小的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，檢查擴(kuò)增產(chǎn)物。紫外觀察PCR產(chǎn)物是否與插入片段大小一致？）
5. 將已經(jīng)接種有菌落的平板置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，使菌落擴(kuò)增；次日挑選陽(yáng)性克隆做進(jìn)一步篩選或培養(yǎng)。步驟2也可以不點(diǎn)板，直接接種搖菌，盡可能安排在早上做PCR，下午就可以提質(zhì)粒，得到重組載體。
�。ㄆ撸┚篜CR鑒定轉(zhuǎn)化子
1. 取培養(yǎng)過(guò)夜的轉(zhuǎn)化菌液20 μL，沸水浴3～5 min。
2. 室溫12 000r/min 離心2min。取上清液作為PCR的摸板，按下列反應(yīng)體系配制
ddH2O 13.5 μL
10×PCR Buffer（25mM Mg離子） 2 μL
dNTP（10mM each） 0.5 μL
Primer l（20μM） 0.5 μL
Primer 2（20μM） 0.5 μL
模板DNA2 μL
TaqDNA聚合酶（2.5U）1 μL
總體積20 μL
3. 加一滴液體石蠟，混勻，短暫離心。
4. 在PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。參考下列程序：
95℃，3 min
95℃，30 s，56℃，30 s，72℃，50 s，30個(gè)循環(huán)
72℃，10 min。
5. 電泳檢測(cè)是否得到目的片斷。
1 最簡(jiǎn)單的：用槍尖或者牙簽從平板或液體中沾少量菌（多了就會(huì)影響反應(yīng)了，沾上點(diǎn)就夠了），直接加入到PCR體系中反應(yīng)就行了，依靠變性溫度來(lái)破裂細(xì)菌釋放DNA，我一直這樣做大量篩選。
2 旁邊實(shí)驗(yàn)室的方法：用槍尖或者牙簽沾少量菌，加入到?jīng)]有加酶的PCR反應(yīng)體系中，沸水浴5min，冷卻后加入酶，開始反應(yīng)，有些不容易加熱破裂的菌預(yù)先煮沸一下，可以釋放更多的DNA，有利于PCR反應(yīng)。
3 用Chelex，旁邊的旁邊的實(shí)驗(yàn)室做菌種鑒定的時(shí)候習(xí)慣用的方法：可以去除一部分雜質(zhì)，降低PCR反應(yīng)所受的干擾。
1) 5%-10%chelex 50μl(配法：5-10g chelex 加入100ml TE)+菌苔，在管壁適當(dāng)研磨，震蕩混勻，短暫離心
2) 煮沸：細(xì)菌5min，放線菌10-15min
3) 冷卻至室溫，10000-12000rpm離心5-8min，取上清擴(kuò)增
注：chelex方法適于細(xì)菌、放線菌，chelex提前在65攝氏度水浴中預(yù)熱，溶液有細(xì)小顆粒，吸取時(shí)槍尖最好先剪掉，否則不好吸。
這3個(gè)方法由簡(jiǎn)到繁，效果當(dāng)然是依次提高了。我理解，這樣的直接以細(xì)菌為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，特別是前兩種，適用于大量的篩選和驗(yàn)證，由于加入了細(xì)菌本身的其他物質(zhì)以及難免引入的培養(yǎng)基成分，可能會(huì)對(duì)PCR反應(yīng)造成干擾，假陽(yáng)性假陰性都是可能出現(xiàn)的，所以之后最好還要進(jìn)一步驗(yàn)證。chelex方法可以去除一定的雜質(zhì)，干擾較小，但是畢竟也不如直接以DNA為模板效果好。樓主需要根據(jù)自己的實(shí)際需要來(lái)選擇合適的方法。
把PCR MIX加好，最好把細(xì)菌用TIP沾點(diǎn)就可以了。變性溫度也不變，時(shí)間可長(zhǎng)點(diǎn)兒，容易。
我也這樣做過(guò)，96度變性時(shí)延長(zhǎng)為10min左右，幾乎都能擴(kuò)增出來(lái)。
但鑒于我做的是革蘭氏陰性菌，對(duì)于陽(yáng)性球菌，還真不好說(shuō)。
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